标本成像分享希尔博士关于外泌体保存的常见问题的解答
希尔博士在接受外泌体NTA检测的技术咨询时，经常会被问到外泌体保存相关的问题。
譬如：
→我的外泌体已经在4度放了一周，还能做检测吗？
→我是1个月前提取的外泌体，一直放在-80度冰箱，还能做粒径检测吗？
→我的样本放在-80度冰箱两个月了，还能提取外泌体做检测吗？
→我在沈阳，寄样本去上海做检测，可以用冰袋寄送吗？
诸如此类………
目前并没有定论来回答以上问题，
抑或——最科学的方式——自行做对照实验去探究。
Example 1
数据来源：Influence of Storage Condition on Exosome Recovery , DOI: 10.1007/s12257-015-0781-x
实验目的：探究不同温度下长时间保存对外泌体样本的影响
实验方法：对HEK 293的细胞培养上清提取分离外泌体，将外泌体样本分成4组，分别保存在-70℃、-20℃、4℃和室温下10天后，进行Western Blot检测，选择的marker为HSP70、CD63、CD9。
实验结果：结果显示，在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。
相较于4℃、-70℃和新鲜样本，室温存放的外泌体蛋白和RNA浓度的降低程度较明显。
本例说明，-20℃或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。
Example 2
数据来源：Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses ，DOI: 10.1080/20013078.2017.1359478
实验目的：探究不同温度下保存对外泌体样本的影响
实验方法：提取分离小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌体，将外泌体样本分为三组——新鲜提取组和分别保存在-80℃、4℃ 4天的两组，通过DLS、TEM和zeta电位观察外泌体的变化。
实验结果：结果显示，相较于新鲜提取的外泌体样本，低温储存4天的样本粒径有一定程度的增大，电位数值降低，颗粒有团聚倾向；从TEM图片看，-80℃保存的外泌体有多层结构产生。
另外，该实验也通过无标记的LC-MS/MS评估了外泌体蛋白质含量，结果表明低温储存一定时间都会引发蛋白质泄露。所以，不论是从外泌体结构还是蛋白质含量角度出发，最好是在分离后立即进行各项实验。
Example 3
数据来源：Handling and storage of human body fluids for analysis of extracellular vesicles, DOI: 10.3402/jev.v4.29260
实验目的：探究单次冻融和不同时间、温度储存对血浆EVs的影响
实验方法：血浆在新鲜状态和分别在-20℃、-80℃、-196℃储存6个月和1年后被检测，通过RPS、NTA和FCM观察粒径和浓度的变化。
实验结果：图a-d的RPS和NTA结果说明不同温度下储存6个月和1年对样本浓度和粒径影响不明显，CD235a和CD61的表达量也没有太大差异，只有lactadherin的表达相对于新鲜样本升高了约7倍（图e）。综上说明，该研究中用到的血浆样本在不同温度下（低温）储存，即便长达1年，也能保持一定的稳定性。
同篇文章对唾液和尿液样本也做了类似研究，得到相近结果。
白色：新鲜血浆；灰色：血浆冻存6个月；黑色：血浆冻存1年
也有研究团队对不同储存条件对外泌体中miRNA稳定性做评估：miRNA in Plasma Exosome is Stable under Different Storage Conditions (doi:10.3390/molecules19021568)。
从这几个例子来看，不同时间、温度的保存对不同的外泌体样本影响不一；如果研究方向为外泌体形态特征、蛋白或其他功能性分析，在分离后新鲜使用为最佳。目前主流的建议是提取出外泌体后最好是新鲜使用，或低温短期保存。
而到底低温保存一定时间后是否对外泌体有什么影响，希尔博士认为还是因样本而异，实在纠结的话，还是做对比实验，用实际数据说话！
以上就是标本成像分享的希尔博士关于外泌体保存的常见问题的解答，希望对您有所帮助。
